桦褐孔菌NRPS/PKS在3种宿主中的表达
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)寄生在白桦树树干上,它的次级代谢产物有多酚类和黑色素类等。其中黑色素是保护真菌细胞免受紫外,氧化胁迫和离子辐射损害的次级代谢产物。
前期研究发现编码杂合非核糖体肽合成酶-聚酮化合物合成酶(NRPS/PKS)基因的表达与水溶性黑色素产量成正比。因此推测NRPS/PKS基因的编码产物是桦褐孔菌的水溶性黑色素。
本研究通过克隆NRPS/PKS的基因,在不同宿主中进行异源表达并获得相应蛋白。以蛋白为催化剂,进行催化反应,体外验证NRPS/PKS编码产物为桦褐孔菌水溶性黑色素。
为桦褐孔菌水溶性黑色素合成研究提供实验基础。之前的研究已获得了NRPS/PKS整合到构巢曲霉WA位点的重组菌株。
摇瓶发酵并提取该重组菌株的产物,以野生的桦褐孔菌的产物为对照,进行清除自由基的试验。结果发现:该重组菌株的产物清除自由基能力与对照相似,但并未捕获相应的蛋白。
为了通过体外实验进一步验证NRPS/PKS可以催化产生水溶性黑色素,在构建NRPS/PKS重组菌株时在适当的位置上添加标签,分别采取融合蛋白表达和分段表达两种策略 ...