大肠杆菌与角叉菜硫代谢基因cysE、cysM和cysC的克隆、表达及生物学特性比较研究
半胱氨酸及非蛋白质氨基酸在科研和医药领域都有广泛的用途。半胱氨酸及非蛋白质氨基酸酶的生物催化与发酵生产因其节能、高效、环保而越来越受到重视。
本文中克隆了大肠杆菌和海藻角叉菜的硫代谢相关基因cysE、cysM和cysC;利用在大肠杆菌中高效表达的同源或异源丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASS-B),获得大量活性稳定的重组酶(生物催化剂);以各种亲核试剂为底物,利用在大肠杆菌中高效重组表达的重组酶合成非蛋白质氨基酸,为下一步通过多酶体系合成半胱氨酸和含硫非蛋白质氨基酸奠定前期工作基础。本论文首先克隆得到cysE-ECOLI基因,其ORF区长822 bp,编码273个氨基酸,理论分子量为29.32 kDa,理论等电点为6.05。
将cysE-ECOLI基因连接到pET-22b(+)表达载体上并进行原核表达,得到在上清液中重组表达的可溶性蛋白,经纯化后,获得了具有活性的重组蛋白,纯化后的酶活性为180 U/mg。为了获得表达量更高,催化活性更强,更适合大量生产的SAT,本论文 ...