大肠杆菌利用甘油生产C4-二羧酸类物质的代谢工程研究
甘油作为生物柴油产业的主要副产物,日益成为一种廉价、可持续的生物发酵工业的原料和底物。C4-二羧酸类物质(琥珀酸、富马酸和苹果酸)在食品、制药、化工等领域都有非常广泛的应用。
本文通过代谢工程和进化工程的策略构建了能够利用甘油为底物高效生产C4-二羧酸类物质的大肠杆菌菌株。首先利用基元模式分析的方法对大肠杆菌在好氧、微氧和厌氧条件下利用甘油为底物生产琥珀酸的代谢网络模型分别进行了系统的计算和分析。
根据基元模式分析的结果,构建了好氧琥珀酸生产菌株,琥珀酸的得率达到0.22 mol/mol甘油,但副产物α-酮戊二酸会大量积累。通过对敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的菌株进行适应性进化,提高了乙醛酸循环的通量,进而使得α-酮戊二酸的产量降低了46%,琥珀酸的得率提高了30%。
通过过表达α-酮戊二酸脱氢酶,进一步大大降低了α-酮戊二酸的产量,并将琥珀酸的得率提高了20%,达到了好氧发酵最大理论得率的67%。此外,异柠檬酸脱氢酶的编码基因icdA的编码区在进化过程中发生了错义突变G583T。
通过将该突变引入对照菌株,大大提高了琥珀酸的得率,说 ...