多酶催化途径的体外构建
体外多酶催化是合成生物学领域发展非常迅速的一种研究方法,它是利用纯化的酶以及辅酶,通过一定的生物化学反应,将底物转化为目标产物的过程。利用体外代谢催化方法,可以不去阐明生物体复杂的细胞代谢,可以提高研究效率。
鉴于体外多酶催化方法的优点,在体外对苏氨酸循环固碳途径进行了验证,同时对体外合成5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的过程进行了优化,提高5-ALA的体外合成量。乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。
然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。本研究在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。
在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(TdcB)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2 mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。 ...