人Kallistatin重组蛋白在CHO细胞中表达及其抗肝癌功能探索
Kallistatin(KAL)是一种多功能蛋白,具有抗氧化应激、抗血管生成、抗纤维化、抗肿瘤等多种活性。本实验室前期运用酵母工程菌发酵并制得其重组蛋白,用于制备其单克隆抗体时发现效价不高,分析可能由于酵母菌表达重组KAL蛋白的分子构象发生变化而致。
于是本文主要构建CHO-K1细胞高表达载体,并筛选高表达KAL蛋白的稳定株,悬浮无血清驯化后,批量表达纯化得到KAL蛋白并探索其对肝癌的作用。本文主要的研究方法和研究结果如下:首先运用基因工程技术构建了含有Kozak序列,人白蛋白信号肽与人工设计的信号肽,穿膜肽TAT与pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN载体相连的18种载体。
用PEI瞬时转染,双抗夹心ELISA检测,选取KAL表达量最高的载体,运用优化的转染条件转染CHO-K1细胞,转染后36 h,消化转移至培养皿中,用筛选浓度G418来筛选,挑取单菌落接种到96孔细胞培养板中,G418继续筛选。7天后ELISA检测细胞上清KAL含量,选取阳性值高(A≥1.0),有限稀释法克隆化。
经三次克隆化后,逐渐 ...